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　　Western blot实验

　　蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot，是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

　　通过抗原抗体反应对目标蛋白的表达进行半定量检测，还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析。WB作为一种方便可靠的研究工具，将与质谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。

实验原理

　　蛋白免疫印迹杂交(Western Blot WB)是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜(blot)上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

实验流程：

　　western blot一般步骤：蛋白质抽提，蛋白质定量，变性聚丙稀酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白质转移，western blot膜的封闭和抗体孵育，western blot结果检测，western blot数据分析。

Western blot、ELISA、免疫荧光、免疫组化的区别：

　　免疫组化或免疫荧光：检测蛋白表达，为定性实验为主，一般应用于组织居多，细胞应用较少，细胞可以使用免疫荧光实验。主要用于考察蛋白的定位、共定位等情况。

　　推荐应用：临床组织、动物组织标本的关键性蛋白检测。

　　western blot：检测蛋白表达或转录后修饰(磷酸化、剪切体、甲基化、苏素化、泛素化、乙酰化、多聚体、降解等)，与其他实验技术结合可以达到多种目的。应用最为广泛。细胞和组织都可以应用，也可以通过提取不同亚细胞组成用于检测蛋白的定位情况。为半定量实验。

　　推荐应用：细胞或组织中通路蛋白、一般蛋白的表达或转录后修饰。

　　ELISA：为定量实验，主要用于分泌型蛋白的检测居多。也可以用于动物血清、组织、细胞上清的蛋白检测。但是不适用于蛋白转录后修饰的检测，不推荐通路相关蛋白的检测。

　　推荐应用：细胞上清、组织、动物血清中分泌型蛋白，如细胞因子的检测。

PCR、western blot、ELISA的取舍?

　　PCR：检测的是mRNA，在一些特定情况下mRNA变化不等同于蛋白变化，如蛋白降解等。此外，某些mRNA是一定可以翻译成蛋白的，如miRNA、lncRNA、circRNA等，这种情况只能选择PCR检测RNA。此外，一些通路蛋白，如p65、β-catenin等，有较多转录后修饰方式，如磷酸化，这种发生于蛋白层面的变化PCR也是无能为力的。

　　推荐应用：临床组织、动物组织标本的mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA检测。

　　western blot：检测蛋白表达或转录后修饰(磷酸化、剪切体、甲基化、苏素化、泛素化、乙酰化、多聚体、降解等)，与其他实验技术结合可以达到多种目的。应用最为广泛。细胞和组织都可以应用，也可以通过提取不同亚细胞组成用于检测蛋白的定位情况。为半定量实验。

　　推荐应用：细胞或组织中通路蛋白、一般蛋白的表达或转录后修饰。

　　ELISA：为定量实验，主要用于分泌型蛋白的检测居多。也可以用于动物血清、组织、细胞上清的蛋白检测。但是不适用于蛋白转录后修饰的检测，不推荐通路相关蛋白的检测。

　　推荐应用：细胞上清、组织、动物血清中分泌型蛋白，如细胞因子的检测。