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外泌体

　　外泌体 (Exosomes) 是细胞分泌到胞外的一种囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs) ,其大小为 30-150nm,具有双层膜结构和茶托状形态,含有丰富的内含物 (包括核酸、蛋白和脂质等) ,参与细胞间的分子传递。外泌体广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中。

外泌体提取的常见问题

　　超速离心法(差速离心和密度梯度离心)：操作繁琐，耗时长，分离外泌体纯度较高，但得率低，目前分离外泌体主流方法。

　　尺寸排阻色谱(Size-exclusion chromatography，SEC)：应用填充多孔聚合物微球的柱子，精确分离大小分子，操作简便，耗时短，分离外泌体纯度较高。

　　聚合物沉淀法：操作简便，耗时短，可能会同时分离非囊泡污染物(包括脂蛋白)，分离外泌体纯度较低。

　　磁珠免疫法：通过特定的抗体组合从样本中捕获不同类型的外泌体，免疫亲和技术具有高特异性、可获得高纯度的外泌体、且不影响外泌体形态完整等优点，是富集表征独特的外泌体的优选方法。但是此方法效率低，外泌体内含物的生物活性易受 pH 和盐浓度影响，不利于下游实验的进行。

　　组合方法：如聚合物沉淀法+SEC(CellGS Exo-spin 外泌体纯化试剂盒)纯化流程温和，无需高速离心，操作简便并且产物纯度高，分离出的外泌体完好无缺，适用于下游功能研究、WB 验证、RNA 分析等。

外泌体鉴定

　　1、透射电镜鉴定法：简称 TEM， 观察外泌体双层囊膜超微结构， 通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。

　　2、纳米颗粒跟踪分析法：简称 NTA，该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快，检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。

　　3、分子标志物检测：WB 法鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中(至少 3 个阳性标志物、1 个阴性标志物)。

　　外泌体相关文献统计，排在前 4 位的检测指标为 CD63、TSG101、CD9、CD81;接着检测较多的 4 个指标为 Alix 、HSP70、flotillin 和 Syntenin 等。

　　然而《MISEV 2018》并未提出可以特异性地表征外泌体的分子标记。仅列出了必须在所有外囊泡制剂中分析的三类标记物，以证明外囊泡(类别 1 和 2)并评估其从常见污染物中的纯度(类别 3)。

　　注：

　　类别 1：跨膜或 GPI 锚定蛋白，质膜和/或胞内体上任何类型外囊泡的标志，如 CD63、CD81、CD82、CD9 等;

　　类别 2：细胞溶质蛋白(cytosolic proteins，真核细胞和革兰氏阳性细菌)或周质蛋白(periplasmicprotei ns，革兰氏阴性细菌)，分析确定脂质双分子层结构，如 TSG101、HSP70、ALIX 等;

　　类别 3：非外囊泡结构的主要成分，通常与外囊泡共同分离。主要用来评估外囊泡制剂的纯度，如血清、血浆中的脂蛋白。

　　即《MISEV 2018》要求外泌体标志物鉴定，至少 2 个阳性指标：CD9、CD63、CD81 三选一以及 TSG101、HSP70、ALIX 三选一，另外纯度鉴定再加阴性对照。